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本试剂盒提供了一种更高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素(Biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，通过生物素-链霉亲和素放大系统，使FITC标记的链霉亲和素与生物素结合，从而可用荧光显微镜检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。

本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片或爬片)的凋亡原位检测。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。

1. 各个样本请用免疫组化笔做好标记，另外加2张样本片分别用于阳性片和阴性片制备并做好标记。
   
2. 在每步反应或浸洗的间隙时，配制下一步即用的工作液。
   
3. 每步反应浸洗时间应充足，浸洗时间短可能会引起背景过高。
   
4. 反应液最好根椐计算好的样本数量集中配制，再分别滴加于各样本上，避免因每个样本单独配制而产生的试剂损耗，TdT酶反应液如需短暂保存时，请置于冰上。
   
5. 操作Streptavidin-FITC时注意避光。

1. 前处理
   
   1. 细胞涂片或冷冻切片
      
      1. 将自然晾干的细胞样本(细胞涂片或爬片)或冷冻切片浸入盛有4%多聚甲醛固定液的染色缸，室温固定20～30min；
         
      2. 样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
   2. 石蜡切片
      
      1. 石蜡切片按常规方法进行脱蜡，60℃烘片60min。二甲苯脱蜡2次，乙醇水合(100%、95%、80%、75%)；每次5min；
         
      2. 切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
2. 通透
   
   1. 细胞涂片或冷冻切片
      
      3. 配制1%Triton X-100通透液；例：99mL的1×PBS加入1.0mL Triton X-100，混匀，即用即配；
         
      4. 样本片浸入通透液中，室温促渗3～5min；之后浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
   2. 石蜡切片
      
      3. 样本浸泡于pH6.0的柠檬酸缓冲液中，微波中高火8分钟左右，再自然晾凉。
         
      4. 配制Proteinase K工作液：计算好样本数量集中配制，每样本90μL 1×PBS加入10μL
         10×Proteinase K，即用即配；每个组织切片上滴加100μL Proteinase K工作液，37℃反应30min。切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
3. 制阳性片
   
   5. (注意：阳性片只针对实验体系进行设置对照，不需要每片制备)根据样本类型不同，配制100μL含不同活性单位U的DNaseⅠ反应液，方法如下：
      

      样本	细胞样本	冷冻切片	石蜡切片
      U/100μL	1000～2000U	2000～3000U	3000～5000U
      DNaseⅠ(50U/μl)	20～40μL	40～60μL	60～100μL
      DNaseⅠBuffer	80～60μL	60～40μL	40～0μL

   6. 在一张样本片上滴加100μL上述配制好的DNaseⅠ反应液，37℃处理30min；
      
   7. 上述阳性片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min；
4. 连接标记
   
   8. 配制TdT酶反应液：配制TdT酶反应液：计算好样本数集中配制(阴性对照片不计)，每样本用量：20μL Equilibration Buffer加10μL ddH2O、2.0μL Biotin-11-dUTP和8.0μL TdT Enzyme，即用即配，注意避光；
      
   9. 样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加40μL TdT酶反应液，放入温盒中，37℃避光反应30～60min，(注：阴性对照样本不加TdT酶反应液)
      
   10. 反应后的样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，注意避光；
       
   11. Streptavidin-FITC试剂按每张切片5μL用量与45μL Labeling Buffer混匀，计算所需的总量后，即用即配，注意避光。
       
   12. 样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μL Streptavidin-FITC标记液，放入湿盒，37℃避光反应30min。
       
   13. 反应后的样本片浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，注意避光；
       
   14. DAPI染色液复染细胞核，室温避光反应10min。洗去DAPI染液，加适量体积比封片剂(甘油：PBS=6：4)，显微镜观察。
5. 检测
   
   15. 荧光显微镜检测：激发波长450～500nm，发射波长515～565nm；
       注：荧光易淬灭，请尽快观察拍照。

1. 石蜡样本：动物经4%多聚甲醛全身灌注后及时取材，样本转移至15、50mL密闭离心管中，4%多聚甲醛固定(组织必须完全浸没在固定液中)，室温存放24h以上，可长期保存，常温密封运输，封口膜封好，组织块不易过大过厚，一般2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度须保持在0.3cm以内(固定液现配使用)。
   
2. 冰冻样本：动物经4%多聚甲醛全身灌注后及时取材，4%多聚甲醛固定24h，30%蔗糖脱水48h以上，-20℃或-80℃冷冻(特殊组织特殊处理：如脑组织，需灌注后取材；眼球需用特殊固定液)。